“[{"title":"生理环境下羟基脯氨酸清除羟基自由基的反应机制","chapter":"0　 引 言","content":"羟基自由基（hydroxyl radical，·OH）被认为是隐藏在人体内的健康杀手。·OH能够通过对DNA、脂肪酸和蛋白质等大分子的攻击，导致细胞损伤和新陈代谢失调，诱发多种疾病[1~3]。环境中客观存在的辐射、农药、食物添加剂以及人类主观的超负荷体育锻炼、酗酒、吸烟等因素均会使生命体产生大量的·OH 以及可以很快转化为·OH的其他活性氧自由基）[4，5]。因此，研究药物分子清除自由基反应的机理对于开发具有清除自由基能力的药物具有重要意义。对·OH与赖氨酸、脯氨酸、半胱氨酸和组氨酸等氨基酸分子反应的理论研究[6~9]表明，水液相下这些氨基酸清除·OH的自由能垒均在40.9 kJ/mol [10]以下，它们可作为·OH的清除剂。文献[11]研究表明，水液相下·OH与布洛芬分子反应的自由能垒在26.0~34.7 kJ/mol之间，低于反应容易进行的能垒（40.9 kJ/mol），说明抗炎药物布洛芬也具有清除·OH的作用。文献[12~14]研究表明，水液相下烯醇式依达拉奉（edaravone，Eda）异构体与超氧阴离子自由基（O2·-）、过氧化氢自由基（·O2H）和·OH反应的最低自由能垒在0.0~12.2 kJ/mol范围，均低于反应快速进行的能垒20.0 kJ/mol[10]，说明烯醇式Eda异构体具有极好的清除自由基的能力。文献[15]研究表明，酮式Eda异构体与O2·-的提取H反应能垒为38.0~41.0 kJ/mol，低于反应温和进行的能垒84.6 kJ/mol[10]，说明烯醇式Eda异构体具有清除O2·-的能力。羟基脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）是动物胶原蛋白质的特征氨基酸[16]。实验研究[17，18]表明，林蛙油、卵和皮中含有羟基脯氨酸，对·OH和O2·-自由基均有较强的清除能力。目前，羟基脯氨酸与自由基反应的理论研究尚未见报道。为了给相关实验研究和科学开发含羟基脯氨酸天然抗氧化剂和保健食品提供理论支撑，依据已有的研究[11，14]，对标题反应进行了深入研究。","result":"介绍了羟基自由基（·OH）对人体健康的潜在危害，以及其在DNA、脂肪酸和蛋白质等大分子上的攻击导致的细胞损伤和疾病。探讨了环境因素和生活习惯对·OH生成的影响，强调了研究药物分子清除自由基反应机理的重要性。通过文献回顾，指出了氨基酸和抗炎药物布洛芬等物质在清除·OH方面的潜力。特别提到了羟基脯氨酸（Hyp）作为胶原蛋白质的特征氨基酸，具有清除自由基的能力，但目前缺乏对其与自由基反应的理论研究。本研究旨在为开发含Hyp的天然抗氧化剂和保健食品提供理论基础。","language":"zh"},{"title":"生理环境下羟基脯氨酸清除羟基自由基的反应机制","chapter":"1　 计算方法","content":"采用M06-2X[19]/6-311+G(d, p)杂化泛函及杂化弥散基组理论水平，在生命体内环境310.15 K和1.013×105 Pa下，对相关反应过程的驻点物种进行结构全优化。极小点（稳定点）红外振动无虚频，过渡状态[20]（鞍点）仅有一个虚频。通过对过渡状态的IRC（内禀反应坐标）计算与分析[21]，确认其与预期的稳定点正确的关联。采用MN15[22]/6-311++G(2df, pd)高精度泛函高水平基组计算单点能。在结构优化以及单点能计算时均采用SMD模型[23]处理，溶剂为水。结合能、解离能和反应热采用焓变，反应活化能垒用自由能变，总焓和总自由能分别为焓校正和自由能校正与单点能的加和。单电子转移反应无过渡状态，自由能垒用马库斯理论[24，25]计算： （1）式中的λ重组能，计算公式为： （2）式中，ΔESET和ΔGSET分别为产物与反应物的非绝热能变和自由能变，SET指单电子转移。ΔESET的计算方法是基于反应物构型的产物（只是电荷量变化）的高水平能量与反应物的高水平能量之差。将·OH攻击底物4-Hyp的H9得到的反应物复合物记作RC_4Hyp··OH_H9，4Hyp被·OH提取H9的过渡状态记作TS_4Hyp··OH_H9，4Hyp被提取H9的产物与H2O分子的复合物记作PC_4Hyp*_H9·H2O，·OH提取H9得到的产物记作P_4Hyp*_H9；·OH攻击4Hyp的C6得到的反应物复合物记作RC_4Hyp··OH_C6，加成到C6的过渡状态记作TS_4Hyp··OH_C6，得到的复合反应物记作RC_4Hyp··OH_C6，加成到C6的过渡状态用TS_4Hyp·OH_C6表示，产物加合物用P_4Hyp··OH—C6表示。其他体系表示法与此相似。驻点电子结构用Gaussian16程序计算，驻点原子的NPA电荷由Gaussian16程序自带的NBO程序计算。驻点原子间的键临界点和环临界点的电荷密度ρBCP、ρRCP以及它们的拉普拉斯值用AIM 2000程序计算。相关驻点分子的几何数据数值用Gauss View 6.0软件读取。","result":"详细描述了羟基脯氨酸清除羟基自由基反应机制的计算方法。使用M06-2X/6-311+G(d, p)杂化泛函和SMD模型在生理条件下对反应物、过渡态和产物进行结构优化。通过IRC分析确认了过渡态与稳定点的正确关联。采用MN15/6-311++G(2df, pd)计算单点能。结合能、解离能和反应热以焓变表示，活化能垒用自由能变表示。单电子转移反应的自由能垒通过马库斯理论计算。详细列出了反应物复合物、过渡态和产物的命名和计算方法。使用Gaussian16程序计算电子结构和NPA电荷，AIM 2000程序计算键临界点和环临界点的电荷密度，Gauss View 6.0软件读取几何数据。","language":"zh"},{"title":"生理环境下羟基脯氨酸清除羟基自由基的反应机制","chapter":"2　 结果与讨论","content":"脯氨酸羟基化可以得到3-、4-、5-羟基脯氨酸衍生物，已有研究[26]表明，在动物胶原蛋白中的羟基脯氨酸主要为4-Hyp，3-Hyp和5-Hyp极少。本文对4-Hyp与·OH的反应进行研究，4-Hyp分子在水液相下的稳定几何构型，见图1。图14-Hyp分子的几何构型Fig.1Geometric configuration of 4-Hyp molecule·OH中O的电子自旋密度为1.025，H的电子自旋密度为-0.025，电子主要分布在O上，·OH与4-Hyp的反应位点是O。·OH与4-Hyp的反应有提取H、加成以及电子转移3种情况。2.1　·OH提取H过程势能面计算表明，·OH提取H14的反应具有绝对的优势。在所有的C—H、N—H和O—H键中，O17—H18的红外振动频率最大（表1），但·OH提取H18的反应并非最具劣势，考虑到H9是被提取序号最小的H。为节约篇幅，本节首先对·OH提取H9、H14和H18的反应进行较全面的讨论，对与其他H原子的反应仅作简要讨论。水液相下OH还可能与H2O及(H2O)2等氢键作用，形成·OH·H2O和·OH·(H2O)2，对提取H9和H18的情况还分别考察了·OH·H2O和·OH·(H2O)2提取H原子的情况。·OH及其水簇提取H9、H14和H18等氢原子的过程见图2，提取其他氢原子的过程见图3，自由能势能面见图4。为节约篇幅，反应物复合物结合能、产物复合物解离能以及反应焓变在文中相应的位置直接给出（详细的计算及计算结果见附加材料中表S1和S2）。表14-Hyp分子C—H键的红外振动频率Table 1Infrared vibration frequency of 4-Hyp molecular C—H bondcm-1图2羟自由基（水簇）与4-Hyp提取H9、H14、H18的反应过程Fig.2The reaction process of hydroxyl radical (water cluster) and 4-Hyp extracting H9, H14, H18图3羟自由基（水簇）与4-Hyp提取H10-13、H15、H16反应的过程Fig.3The reaction process of hydroxyl radical (water cluster) and 4-Hyp extracting H10-13, H15, H16图4羟自由基（水簇）与4-Hyp提取H反应的势能面Fig.4Potential energy surface of hydroxyl radical (water cluster) and 4-Hyp extracting H2.1.1　·OH提取H9首先，·OH从物理无穷远攻击H9，同时与羰基氧O8作用。当O19与H9距离为0.308 88 nm，H20与O8距离为0.166 19 nm时，·OH与4-Hyp通过范德华力和氢键作用，形成反应物复合物RC_4Hyp·OH_H9，放热26.8 kJ/mol（RC_4Hyp··OH_H9的4-Hyp与·OH结合能是26.8 kJ/mol）。该热量被水迅速吸收，不会被后续反应利用，后文相似处不再赘述。然后，RC_4Hyp··OH_H9的C1—H9键长从0.108 86 nm拉伸至0.116 60 nm，其ρBCP从0.283 70减小至0.224 39，从-0.983 11变为-0.610 63，该共价键强度变弱。电子密度拓扑分析表明，H20与O8之间的氢键断裂，形成过渡态TS_4Hyp··OH_H9，其产生的自由能垒为24.9 kJ/mol。接着，越过过渡态，H9继续向O19迁移，与·OH结合形成水分子H2O，得到产物复合物PC_4Hyp*_H9·H2O。O8—H20的ρBCP为0.034 68，是0.130 93，H2O与P_4Hyp*_H9间的O8为氢键作用。C1与H9的ρBCP为0.0，NPA电荷计算表明，C1与H9间存在弱的库仑作用，下文相似处不再赘述。该反应的活化能垒（24.9 kJ/mol）明显低于40.9 kJ/mol[11]，属于较快速的反应，下文相似之处不再说明。从反应物复合物到产物复合物的反应伴随着较显著的放热效应（ΔH=-87.0 kJ/mol）。最后，PC_4Hyp*_H9·H2O吸收12.7 kJ/mol的能量（此能量可通过分子间碰撞获得，后文相似处不再说明），解离成P_4Hyp*_H9和H2O。PC_4Hyp*_H9·H2O中H2O分子电荷量是-0.028 e，其解离后的H2O电荷量为0.0 e，说明·OH提取H9是H原子迁移过程。·OH（水簇）提取H均为H原子迁移过程，下文相似处不再说明。2.1.2　·OH·H2O提取H9自由基·OH·H2O攻击H9的同时，与羰基氧O8作用。当O19与H9距离为0.273 17 nm，H23与O8距离为0.172 34 nm时，·OH·H2O与4-Hyp通过氢键和库仑作用，形成RC_4Hyp··OH·H2O_H9反应物复合物，放热23.5 kJ/mol。然后，RC_4Hyp··OH·H2O_H9的C1—H9键长从0.108 92 nm拉伸至0.117 95 nm，共价键强度减弱；H20与O21的距离从0.171 95 nm增加至0.183 90 nm，H23与O8的距离从0.172 34 nm增加至0.178 72 nm，两条氢键变弱，形成过渡态TS_4Hyp··OH·H2O_H9，产生24.4 kJ/mol的能垒（该能垒与前文讨论的OH提取H9得能垒24.9 kJ/mol基本相同）。然后，越过过渡态，H9继续向O19迁移，与·OH·H2O结合成二聚水(H2O)2，形成PC_4Hyp*_H9·(H2O)2产物复合物。此反应过程有较显著的放热效应（ΔH=-101.1 kJ/mol）。最后，PC_4Hyp*_H9·(H2O)2解离，生成PC_4Hyp*_H9和(H2O)2，解离能29.0 kJ/mol。2.1.3　·OH提取H14首先，·OH从无穷远攻击H14。当O19与H14距离为0.249 78 nm时，·OH与4Hyp通过范德华力，形成反应物复合物RC_4Hyp··OH_H14，放热2.6 kJ/mol。然后，C4—H14键长从0.109 23 nm拉伸至0.114 72 nm，其ρBCP从0.285 58减小至0.240 19，始终为负，该共价键强度变弱，形成TS_4Hyp··OH_H14过渡态，产生的能垒为5.3 kJ/mol。接着，越过过渡态，H14继续向O19迁移，与·OH结合成H2O，得到产物复合物PC_4Hyp*_H14·H2O。该反应能垒比快速反应能垒10.0 kJ/mol[11]低很多，属于极快速反应。从反应物复合物到产物复合物伴随着显著的放热效应（ΔH=-96.6 kJ/mol）。最后，PC_4Hyp*_H14·H2O解离成产物P_4Hyp*_H14和H2O，解离能仅为4.5 kJ/mol。2.1.4　·OH提取H18首先，·OH攻击H16。当O19距离H18为0.198 98 nm时，·OH与4Hyp氢键作用，形成反应物复合物RC_4Hyp·OH_H18，放热6.0 kJ/mol。然后，O17—H18键长从0.096 91 nm拉伸至0.107 92 nm，共价作用减弱，形成TS_4Hyp·OH_H18过渡态，其产生的能垒为28.9 kJ/mol。接着，越过过渡态H18继续向O19迁移，与·OH结合成H2O，得到产物复合物PC_4Hyp*_H18·H2O。该反应放热（ΔH=-46.0 kJ/mol）。最后，PC_4Hyp*_H18·H2O解离成产物P_4Hyp*_H18和H2O，解离能仅有2.4 kJ/mol。2.1.5　·OH·(H2O)2提取H18首先，自由基·OH·(H2O)2攻击H18。当O19与H18距离为0.201 97 nm，H26与O7距离为0.179 75 nm时，·OH·(H2O)2与H18以及O7氢键作用，得到RC_4Hyp··OH·(H2O)2_H18反应物复合物，放热28.2 kJ/mol。然后，O17—H18键长从0.096 96 nm拉伸至0.109 31 nm，共价键强减弱；H26与O7的距离从0.179 75 nm拉近至0.178 85 nm，形成过渡态TS_4Hyp··OH·(H2O)2_H18，产生的能垒为27.3 kJ/mol。接下来越过过渡态，H18继续向O19迁移，与·OH·(H2O)2结合成(H2O)3，得到产物复合物PC_4Hyp*_H18·(H2O)3。反应具有放热效应（ΔH=-42.7 kJ/mol）。最后，PC_4Hyp*_H18·(H2O)3解离成产物P_4Hyp*_H18和(H2O)3，解离能26.7 kJ/mol。2.1.6　·OH提取H10首先，·OH攻击H10。当O19与H10距离为0.231 16 nm时，·OH与4Hyp弱氢键作用，形成反应物复合物RC_4Hyp··OH_H10，少许放热6.9 kJ/mol。然后，N2—H10键长从0.102 15 nm拉伸至0.116 42 nm，共价键强度减弱；形成过渡态TS_4Hyp··OH_H10，产生34.6 kJ/mol的能垒。接着，越过过渡态，H10继续向O19迁移，与·OH结合成H2O，形成PC_4Hyp*_H10·H2O产物复合物。此反应过程有明显的放热效应（ΔH=-89.1 kJ/mol）。最后，PC_4Hyp*_H10·H2O解离成P_4Hyp*_H10和H2O，解离能很小，仅有2.0 kJ/mol。2.1.7　·OH提取H11首先，·OH攻击H11的同时与羟基氧O17作用。当O19与H11距离为0.236 37 nm，H20与O17距离为0.189 19 nm时，·OH与4Hyp库仑和弱氢键作用，形成反应物复合物RC_4Hyp·OH_H11，放热13.7 kJ/mol。然后，N2—H11键长从0.103 17 nm拉伸至0.133 29 nm，共价键强度显著减弱；H20与O17的距离从0.189 19 nm增加至0.240 52 nm，氢键断裂，形成过渡态TS_4Hyp·OH_H11，产生30.4 kJ/mol的能垒。接着，越过过渡态，H11继续向O19迁移，与·OH结合成H2O，形成PC_4Hyp*_H11·H2O产物复合物。此反应具有放热效应（ΔH=-97.7 kJ/mol）。最后，PC_4Hyp*_H11·H2O解离成P_4Hyp*_H11和H2O，解离能12.9 kJ/mol。2.1.8　·OH提取H12首先，·OH攻击H12。当O19与H12距离为0.260 75 nm时，·OH与4Hyp通过范德华力，形成反应物复合物RC_4Hyp·OH_H12，放热6.9 kJ/mol。然后，C3—H12键长从0.108 85 nm拉伸至0.118 34 nm，共价键强度减弱；形成了过渡态TS_4Hyp·OH_H12，产生22.5 kJ/mol的能垒。接着，越过过渡态，H12继续向O19迁移，与·OH结合成H2O，形成PC_4Hyp*_H12·H2O产物复合物。此反应过程放热78.2 kJ/mol。最后，PC_4Hyp*_H12·H2O解离成P_4Hyp*_H12和H2O，解离能11.5 kJ/mol。2.1.9　·OH提取H13首先，·OH攻击H13的同时与羰基氧O7作用。当H20与O7距离为0.177 33 nm，O19与H13距离为0.289 72 nm时，·OH与4Hyp弱氢键和库仑作用，形成反应物复合物RC_4Hyp·OH_H13，放热20.1 kJ/mol。然后，C3—H13键长从0.108 78 nm拉伸至0.120 17 nm，共价键强度减弱；H20与O7的距离从0.177 33 nm增加至0.190 53 nm，氢键作用变弱，形成过渡态TS_4Hyp·OH_H13，产生36.0 kJ/mol的能垒。接着，越过过渡态，H13继续向O19迁移，与·OH结合成H2O，形成PC_4Hyp*_H13·H2O产物复合物。此反应放热69.4 kJ/mol。最后，PC_4Hyp*_H13·H2O解离成P_4Hyp*_H13和H2O，解离能15.9 kJ/mol。C3—H13键和C3—H12键有着相同的红外振动频率，但TS_4Hyp··OH_H13和TS_4Hyp··OH_H13产生不同的能垒，这说明红外振动频率不是判断活性位点的可靠数据。2.1.10　·OH提取H15首先，·OH攻击H15。当O19与H15距离为0.270 26 nm时，·OH与4Hyp通过范德华力，形成反应物复合物RC_4Hyp·OH_H15，放热3.3 kJ/mol。然后，C4—H14键长从0.109 06 nm拉伸至0.116 08 nm，共价键强度减弱，形成TS_4Hyp·OH_H15过渡态，其产生的能垒为11.7 kJ/mol。接着，越过过渡态，H15继续向O19迁移，与·OH结合成H2O，得到产物复合物PC_4Hyp*_H15·H2O。该反应属于快速反应，并且伴随着较显著的放热效应（ΔH=-86.2 kJ/mol）。最后，PC_4Hyp*_H15·H2O解离成产物P_4Hyp*_H15和H2O，解离能仅3.0 kJ/mol。2.1.11　·OH提取H16首先，·OH攻击H16。当H20与O8距离为0.177 37 nm，O19与H16距离为0.270 60 nm时， ·OH与4Hyp氢键和通过范德华力，形成反应物复合物RC_4Hyp··OH_H16，放热18.6 kJ/mol。然后，C5—H16键长从0.108 82 nm拉伸至0.118 85 nm，共价键强度减弱；H20与O8的距离从0.177 37 nm增加至0.183 86 nm，氢键作用变弱，形成过渡态TS_4Hyp··OH_H16，产生22.9 kJ/mol的能垒。接着，越过过渡态，H16继续向O19迁移，与·OH结合成H2O，形成PC_4Hyp*_H16·H2O产物复合物。此反应放热83.4 kJ/mol。最后，PC_4Hyp*_H16·H2O解离成P_4Hyp*_H16和H2O，解离能15.7 kJ/mol。C5—H15和C5—H16的红外振动频率相同，但TS_4Hyp··OH_H15和TS_4Hyp··OH_H16产生不同的能垒，说明红外振动频率并不是判断活性位点的可靠数据。从上述结果可以看出，·OH提取4Hyp的氢原子的活化自由能垒在5.3~34.6 kJ/mol之间，均低于反应自发进行的能垒40.2 kJ/mol[10]，说明·OH提取4Hyp氢原子的反应均为动力学允许的过程。其中，·OH提取H14和H15是快速反应过程（能垒均低于反应快速进行的能垒13.5 kJ/mol[10]），说明杂环氢H14和H15是提氢反应活性位点。同时，·OH提取4Hyp氢原子的反应均为热力学所允许的放热过程。另外，与文献[6]研究结果（·OH提取脯氨酸氢原子的优势反应自由能垒在33.3~36.5 kJ/mol之间）相比，脯氨酸羟基化后抗氧化活性显著增加。2.2　·OH加成到4Hyp的过程4-Hyp只有去质子化羧基的C6原子不饱和，·OH加成到C6的反应过程见图5，反应的自由能势能面见图6，为节约篇幅，反应物复合物结合能及反应焓变在文中相应的位置直接给出。图5羟自由基与4-Hyp加成反应的过程Fig.5The addition reaction process of hydroxyl radical and 4-Hyp图6羟自由基与4-Hyp加成反应的势能面Fig.6Potential energy su","result":"详细研究了4-羟基脯氨酸（4-Hyp）与羟基自由基（·OH）之间的反应机制。研究发现，动物胶原蛋白中的羟基脯氨酸主要为4-Hyp，而3-Hyp和5-Hyp含量较少。文章通过计算和实验数据，探讨了·OH与4-Hyp反应的不同途径，包括氢原子提取、加成反应和电子转移。\n\n在氢原子提取过程中，·OH与4-Hyp的反应主要发生在氧原子上。通过势能面计算，发现·OH提取H14的反应具有绝对优势。文章详细讨论了·OH提取H9、H14和H18的反应过程，并简要提及了与其他氢原子的反应。研究发现，·OH及其水簇在提取H9、H14和H18等氢原子的过程中，反应的活化自由能垒在5.3~34.6 kJ/mol之间，均低于反应自发进行的能垒，说明这些反应均为动力学允许的过程。其中，·OH提取H14和H15的反应能垒较低，表明杂环氢H14和H15是提氢反应的活性位点。\n\n在加成反应中，·OH可以加成到4-Hyp的C6原子上。文章通过图5和图6展示了加成反应的过程和势能面。反应物复合物的结合能和反应焓变在文中相应位置给出。\n\n此外，文章还讨论了·OH与4-Hyp反应过程中可能涉及的氢键作用。例如，在提取H9的过程中，·OH与4-Hyp形成反应物复合物时，伴随着放热效应。在提取H14的过程中，反应能垒较低，属于极快速反应。文章指出，红外振动频率并不是判断活性位点的可靠数据，因为具有相同红外振动频率的C—H键可能产生不同的反应能垒。\n\n总体而言，深入探讨了4-Hyp与·OH的反应机制，包括氢原子提取和加成反应。研究结果表明，4-Hyp羟基化后具有较高的抗氧化活性，为理解胶原蛋白在生理环境中的抗氧化作用提供了重要信息。","language":"zh"},{"title":"生理环境下羟基脯氨酸清除羟基自由基的反应机制","chapter":"3　 结 语","content":"本文采用密度泛函理论的M06-2X和MN15方法对4Hpy与·OH在水液相下的反应机理进行研究，得出如下结论：1） 4-Hpy可通过OH提取H原子的反应、与·OH加成反应以及电子转移反应3种方式消除·OH；2） ·OH提取H反应最具优势，反应能垒在5.3~36.0 kJ/mol之间，均为动力学和热力学所允许的过程，杂环氢H14和H15是提氢反应的最佳活性位点；3） ·OH加成到4Hyp是能垒为77.7 kJ/mol的温和反应；4） 单电子从4-Hyp向·OH转移的反应无法实现。结果表明，脯氨酸羟基化后抗氧化活性显著增加，生理环境下4-Hyp可通过提供H原子的方式快速消除·OH，含有羟基脯氨酸的林蛙油、卵和皮等可用作相关的药品和保健品。","result":"介绍了羟基脯氨酸在生理环境下通过三种方式清除羟基自由基的机制，包括OH提取H原子、加成反应和电子转移，其中OH提取H原子反应为主导，具有较低的反应能垒和高动力学及热力学可行性，杂环氢H14和H15为最佳活性位点，脯氨酸羟基化后抗氧化活性显著提升，可应用于药品和保健品。","language":"zh"}]”